Innovative Biosynthese, künstliche Intelligenz

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21851 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Eine auf Mikroben basierende Strategie in der Nanotechnologie bietet wirtschaftliche, umweltfreundliche und biologische Sicherheitsvorteile gegenüber herkömmlichen chemischen und physikalischen Protokollen. Die aktuelle Studie beschreibt ein neuartiges Biosyntheseprotokoll für Chitosan-Nanopartikel (CNPs), das den Pionier Streptomyces sp. Stamm NEAE-83, der ein signifikantes Potenzial für die CNP-Biosynthese aufwies. Es wurde aufgrund seiner morphologischen und physiologischen Eigenschaften sowie der 16S-rRNA-Sequenz als Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 identifiziert (GenBank-Zugangsnummer: MG384964). CNPs wurden durch SEM, TEM, EDXS, Zetapotential, FTIR, XRD, TGA und DSC charakterisiert. Die CNP-Biosynthese wurde mithilfe eines mathematischen Modells, dem Face-Centered Central Composite Design (CCFCD), maximiert. Die höchste Ausbeute an CNPs (9,41 mg/ml) wurde in Lauf Nr. erzielt. 27, mit einem anfänglichen pH-Wert von 5,5, 1 % Chitosan, 40 °C und einer Inkubationszeit von 12 Stunden. Innovativerweise wurde das künstliche neuronale Netzwerk (ANN) zur Validierung und Vorhersage der CNP-Biosynthese auf der Grundlage der Versuchsdaten von CCFCD verwendet. Trotz der hohen Präzision beider Modelle war ANN im Vergleich zu CCFCD überlegen bei der Vorhersage der CNP-Biosynthese. ANN hatte eine höhere Vorhersagewirksamkeit und niedrigere Fehlerwerte (RMSE, MDA und SSE). Vom Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 biosynthetisierte CNPs zeigten in vitro eine antibakterielle Aktivität gegen Pectobacterium carotovorum, das die Kartoffelweichfäule verursacht. Diese Ergebnisse deuten auf eine mögliche Anwendung zur Bekämpfung der zerstörerischen Weichfäulekrankheiten bei Kartoffeln hin. Dies ist der erste Bericht über die Biosynthese von CNPs unter Verwendung eines neu isolierten; Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 als umweltfreundlicher Ansatz und Optimierung des Biosyntheseprozesses durch künstliche Intelligenz.

Actinomyceten umfassen eine große, einzigartige Gruppe grampositiver und aerober Actinobakterien mit einem hohen GC-Gehalt im Genom (69–73 %). Actinomyceten produzieren verzweigtes Substrat und Luftmyzel, das sich durch die Bildung von Querwänden in den mehrkernigen Luftfilamenten zu Sporenketten entwickelt. Diese Bakteriengruppe ist im Boden weit verbreitet und weist zahlreiche Pigmentierungsmuster auf1,2. Aufgrund ihrer Fähigkeit, zahlreiche sekundäre Metaboliten mit Mehrwert zu produzieren und verschiedene Anwendungen in biologischen Prozessen zu ermöglichen, sind Streptomyces-Arten die industriell bedeutendsten unter den Actinomyceten3,4,5. Eine neu aufkommende und vielversprechende Anwendung von Actinomyceten ist ihre Anwendung bei der Biosynthese von Nanopartikeln1,6.

In den letzten Jahren haben Nanopartikel aufgrund ihrer faszinierenden Eigenschaften große Aufmerksamkeit erregt7. Im Vergleich zu Massenmaterialien weisen Nanopartikel aufgrund ihres größeren Oberflächen-Volumen-Verhältnisses eine hohe Reaktionsaktivität auf8. Im Allgemeinen können Nanopartikel auf chemischem, physikalischem, mechanischem oder biologischem Weg erzeugt werden9.

Es gibt nicht-biologische Methoden, die biokompatible nanostrukturierte Systeme ohne den Einsatz schädlicher oder teurer Materialien wie Chitosan oder Albumin mit Natriumtripolyphosphat (TPP) bereitstellen10,11,12. Dennoch tragen eine Reihe von Hindernissen zu den Einschränkungen der nicht-biologischen Methoden bei, darunter die hohen Kosten, der Einsatz von hohem Druck, Energie, Temperatur, gefährlichen Verbindungen und großen Partikelgrößen13. Die gefährlichen Chemikalien schränken den Einsatz von Nanopartikeln im medizinischen und klinischen Bereich ein. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Etablierung umweltfreundlicher Alternativmethoden zur Synthese von Nanopartikeln9. Darüber hinaus bietet die umweltfreundliche und wirtschaftliche Synthese von Nanopartikeln auf mikrobieller Basis Sauberkeit, Sicherheit und Beständigkeit. Darüber hinaus können durch die Reduktionsfähigkeit der mikrobiellen Metaboliten leicht monodisperse Nanopartikel erzeugt werden9.

Chitosan ist ein deacetyliertes Derivat von Chitin, das aus einem linearen Polysaccharid aus verknüpften (β1 → 4) Resten von N-Acetyl-2-amino-2-desoxy-d-glucose (Glucosamin) und 2-Amino-2-desoxy-d besteht -Glucose (N-Acetylglucosamin). Es ist biologisch abbaubar, in einem wässrigen sauren Medium durch primäre Aminprotonierung löslich und die freien Aminogruppen erzeugen eine positive Ladung an seinen Polymerketten14,15.

Die Erneuerung und Verwendung von Chitosan hat ein wachsendes Interesse in einem vielfältigen Bereich geweckt, z. B. wurden die antimikrobiellen Breitbandeigenschaften gegen zahlreiche Krankheitserreger beschrieben16. Interessanterweise wurde Chitosan früher zur Synthese metallischer Nanopartikel als Reduktions- und/oder Stabilisierungsmittel verwendet. Darüber hinaus wird Chitosan selbst seit langem als Material zur Herstellung von Chitosan-Nanopartikeln verwendet. Die natürliche Zubereitung von Chitosan-Nanopartikeln (CNPs) weist mehrere vorteilhafte Eigenschaften auf, z. B. Biokompatibilität, Ungiftigkeit, biologische Abbaubarkeit und Umweltsicherheit. Darüber hinaus weisen CNPs eine hohe Permeabilität durch biologische Membranen auf und werden daher für eine Vielzahl biologischer Anwendungen bevorzugt14,15 .

Die Response Surface Methodology (RSM) ist ein Modellierungsansatz, der eine effiziente statistische Technik zur Optimierung der Variablen und der Prozessleistung bietet. RSM ist kosteneffektiv, reduziert die Gesamtzahl der durchgeführten Experimente zur Bewertung zahlreicher Variablen, ist anwendbar, identifiziert die optimalen Bedingungen und behält im Vergleich zur herkömmlichen Methode ein hohes Maß an Präzision für den höchsten Ertrag bei17,18,19.

Das künstliche neuronale Netzwerk (ANN) ist das zentrale Element der künstlichen Intelligenz und eines der wichtigsten Lehrmittel für maschinelles Lernen20,21. Wie das menschliche Gehirn ist KNN ein fortschrittliches Werkzeug, das Daten analysieren und verarbeiten und so effizient Rechenmodelle mit miteinander kommunizierenden Punkten (Knoten) innerhalb der verborgenen Schicht(en) erstellen kann. Diese Art der Modellierung ermöglicht das Erlernen der Datenmuster und somit das Treffen genauer Entscheidungen auf der Grundlage gegebener Untersuchungsdaten. Durch die ANN-Modellierung wird die Netzwerkarchitektur ausgewählt und anschließend die verborgene(n) Schicht(en) mit genügend Neuronen aufgebaut. Ein solches Netzwerk beginnt mit Lern- und Trainingsprozessen, bis es das Datenmuster versteht. Abschließend erfolgt die Validierung und Verifizierung des resultierenden ANN-Modells vor der Genehmigung des Vorhersagemodells20,21.

Der Lernmechanismus von ANN basiert auf der Diagnose der unterschiedlichen Designs in den Daten, um etwaige Unterschiede zu erkennen und zu entscheiden, welches Muster das Ziel erreicht. Dieser Prozess wird durch intelligente Backpropagation gesteuert, die das gewünschte Ergebnismodell generiert, das das Ziel erreicht. Das Deep-Learning-Verfahren ist angeblich wahrheitsgetreuer und kann die anderen Modellierungsrichtlinien effektiv ersetzen20,21.

Schwarzbeinigkeit und bakterielle Weichfäule, verursacht durch Pectobacterium carotovorum (pervers Erwinia carotovora genannt), gehören zu den wichtigsten Krankheiten, die durch verminderten Ertrag und Qualität zu wirtschaftlichen Verlusten bei Kartoffeln und anderen Gemüsepflanzen führen. Die Weichfäulekrankheit kann auch Kartoffelknollen im Boden und bei der Lagerung befallen22,23. Pectobacterium carotovorum ist ein gramnegatives, aggressives nekrotrophes Bakterium, das verschiedene Enzyme produziert, die die Zellwand von Pflanzen abbauen, darunter Pektinasen, Polygalacturonase, Cellulasen und Proteasen, was zur Mazeration von Pflanzengewebe und zu Weichfäulesymptomen führt24. Die Kontamination der Knollen ist der Hauptweg für die Ausbreitung der Krankheit, da bakterielle Krankheitserreger die Knollenoberfläche besiedeln und symptomlos bleiben25. Die traditionelle Strategie zur Bekämpfung der Moderfäule beschränkte sich auf den Einsatz von Bakteriziden und Antibiotika. Viele dieser Verbindungen wurden in Industrieländern wegen ihrer Gefahr für Ökosysteme und die öffentliche Gesundheit verboten26. Daher besteht ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung neuer Methoden, beispielsweise der Verwendung von Nanomaterialien zur Begrenzung des Einsatzes von Pestiziden.

Zur mikrobiellen Umwandlung von Chitosan in Nanopartikel liegen keine Belege vor. Um diese Kluft zu schließen, wurde zusammen mit ANN ein einzigartiges mikrobielles System (Streptomyces microflavus) als neuartiger Modellierungsansatz entwickelt, um die Betriebsparameter der CNP-Biosynthese zu optimieren. Die Charakterisierung der biofabrizierten Nanopartikel wurde dokumentiert.

Die neuere Nanotechnologie hat aufgrund ihrer bevorzugten Eigenschaften, insbesondere bei der Anwendung auf biologische Systeme, eine einzigartige Stellung im modernen Leben eingenommen. Im Vergleich zu Massenmaterialien zeigen Nanopartikel (NPs) aufgrund ihrer geringen Größe, unterschiedlichen Formen sowie unterschiedlichen optischen, thermischen, elektrischen und mechanischen Eigenschaften neuartige Verhaltensweisen. Zu den organischen Nanopartikeln gehören solche, die aus organischen Komponenten wie Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, Polymeren wie Chitosan und anderen organischen Substanzen hergestellt werden. Typischerweise sind diese NPs biologisch abbaubar und ungiftig27. Der voraussichtliche Anwendungsbereich organischer NPs wird durch verschiedene Kriterien bestimmt, darunter Zusammensetzung, Oberflächenform, Stabilität, Tragfähigkeit und andere27.

Für die Herstellung von Nanopartikeln wurden mehrere Protokolle angegeben. Physikalische und chemische Ansätze sowie Mischverfahren nutzen hochkonzentrierte Stabilisatoren und Reduktionsmittel, die sowohl für die Umwelt als auch für die menschliche Gesundheit schädlich sind. Das biologisch basierte Verfahren hat mehrere Vorteile mit sich gebracht. Die Technik ist ein einstufiger Prozess und daher umweltfreundlich, ungiftig und erfordert weniger Energie. Darüber hinaus weist das Produkt auf biologischer Basis eine größere Stabilität auf28. Die auf mikrobiellen Fabriken basierende Nanopartikelsynthese war anderen Methoden überlegen. Der größte Teil der Biofabrikation von Nanopartikeln ist auf Metallionen beschränkt, und es wurden keine Beschreibungen der Biofabrikation von CNPs auf mikrobieller Basis erstellt. Mikrobielle Fabriktechniken folgen jedoch den Prinzipien der grünen Chemie und die biosynthetisierten Chitosan-Nanopartikel sind stabil, ungiftig und frei von potenziell schädlichen chemischen Verbindungen29,30.

Insgesamt zehn morphologisch unterschiedliche Actinomycetenstämme wurden auf ihr Potenzial für die Biosynthese von Chitosan-Nanopartikeln untersucht. Unter diesen Isolaten zeigten 5 Isolate eine offensichtliche Fähigkeit zur Biosynthese von CNPs. Von ihnen ist das vielversprechendste Isolat Streptomyces sp. Der Stamm NEAE-83 wurde für weitere Studien ausgewählt. Nach bestem Wissen der Autoren wurde in keinem früheren Versuch die Synthese von CNPs durch Streptomyces sp. beschrieben. Stamm NEAE-83. In der aktuellen Studie wurde über einen bahnbrechenden Biofabrikationsprozess von CNPs unter Verwendung eines neu isolierten Streptomyces sp. berichtet. Stamm NEAE-83.

Das bakterielle Herstellungsmuster von CNPs wurde in den UV/VIS-Spektren von 200 bis 400 nm überprüft und untersucht (Abb. 1A). Die optischen Merkmale des erzeugten CNPs-Biopolymers zeigten einen einzelnen starken Peak mit der größten Absorption bei 310 nm. Abbildung 1B,C zeigt drei Fläschchen mit Chitosan: Streptomyces sp. Stamm NEAE-83-Überstand und die CNPs sowie die Nanopartikel nach Extraktion und Trocknung.

(A) UV/sichtbare Spektren von Chitosan (blaue Linie) und Chitosan-Nanopartikeln (rote Linie), (B) Fläschchen mit Chitosan-Lösung (B1), Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83-Filtrat (B2) und die biosynthetisierten Chitosan-Nanopartikel (B3). ) und (C) getrocknete Chitosan-Nanopartikel, biosynthetisiert unter Verwendung des Streptomyces microflavus-Stamms NEAE-83.

Die Einzelpeakabsorption bei 310 nm CNPs von Streptomyces sp. Stamm NEAE-83 im UV-Bereich liegt im zuvor berichteten Bereich von 285 nm30 und 320 nm15. Das UV-/sichtbare Spektrum von CNPs gilt als Indikator für den Erfolg des Biosyntheseprozesses, wobei es bei CNPs scharf ist, bei Chitosan jedoch eine breitere Absorptionsbande aufweist15,30.

Die aktuellen Streptomyces sp. Der Stamm NEAE-83 wurde anhand seiner Kultur, Morphologie, zellphysiologischen Eigenschaften und der 16S-rRNA-Sequenz vollständig klassifiziert. Es war unbeweglich, aerob und bildete ein langes, gut entwickeltes Substratmyzel. Die Rückseite der Kolonie war braun und die Farbe des Myzels war grau ohne diffusionsfähige Pigmente (Abb. 2A). Die koloniale Morphologie stimmte mit der Gattung Streptomyces überein31,32.

(A) Farbiges Myzel von Streptomyces sp. Stamm NEAE-83. gewachsen auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-Medium. (B) Clearance-Zone hydrolysierter Stärke durch extrazelluläre Streptomyces sp. Amylasen von. (C) Milchkoagulation und Peptonisierung.

Die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme (Abb. 3) zeigt, dass vegetative Luftmyzelien reichlich vorhanden und gut entwickelt sind und die Lufthyphen lang sind. Es konnte festgestellt werden, dass sich die Lufthyphen in Rectiflexibiles-Sporenketten differenzierten, die mehr als 30 Sporen mit glatter Oberfläche und einer Größe von 0,33 ± 0,04 × 0,89 ± 0,10 µm trugen. Die Luftsporen sind länglich.

Die Verzierung der Sporenkettenmorphologie und der Sporenoberfläche von Streptomyces sp. Stamm NEAE-83 bei 9.500-facher (A) und 16.000-facher (B) Vergrößerung, nachgewiesen durch Rasterelektronenmikroskopie.

Die Daten in Tabelle 1 zeigten die physiologischen Merkmale von Streptomyces sp. Stamm NEAE-83. Milchkoagulation, Peptonisierung, Stärkehydrolyse, Verflüssigung von Gelatine, Protease, Uricase, Cellulase und Chitosanase waren positiv, L-Asparaginase, Nitratreduktion, Melanoidpigment und H2S-Produktion waren jedoch negativ. Die optimale mikrobielle Entwicklung erfolgte bei 30–37 °C und einem pH-Wert von 7 mit einer NaCl-Toleranz von bis zu 3 % (Gew./Vol.). Diffusionsfähige Pigmente wurden nicht nachgewiesen. Diese Identifizierungskriterien orientieren sich meist an der Gattung Streptomyces2,31,32. Ein anderer, der Streptomyces sp. Der Stamm NEAE-83 zeigte keine antimikrobielle Aktivität gegen alle getesteten grampositiven und gramnegativen Bakterien und Pilzstämme.

Der phylogenetische Nachbarbaum (Abb. 4B), der auf der Grundlage der Sequenz des 16S-rRNA-Gens (1214 bp) erstellt wurde, zeigt die Assoziationen zwischen Streptomyces sp. Stamm NEAE-83 und verwandte Arten der Gattung Streptomyces in der GenBank. Die Analyse des Stammbaums ergab, dass Streptomyces sp. Stamm NEAE-83 fällt in eine Klade zusammen mit Streptomyces microflavus-Stamm (GenBank/EMBL/DDBJ-Zugangsnr. MT973973.1), Streptomyces fimicarius-Stamm U25 (GenBank/EMBL/DDBJ-Zugangsnr. MT355869.1) und Streptomyces lavendulae-Stamm L18 (GenBank/EMBL/DDBJ-Zugangsnr. MT355862.1).

Der Überblick über die Elektrophorese des Agarosegels der PCR-Produktbanden des amplifizierten 16S-Fragments (1214 bp), erhalten aus Streptomyces sp. Stamm NEAE-83 (MG384964) (A) und der benachbarte phylogenetische Baum (B).

Laut der Untersuchung der 16S-rRNA-Sequenz von Streptomyces sp. Stamm NEAE-83, zusammen mit seinen morphologischen und physiologischen Eigenschaften, Streptomyces sp. Stamm NEAE-83 wurde als Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 klassifiziert. Der Stamm wurde in der Genbank hinterlegt und die Zugangsnummer wurde als MG384964 erhalten.

Nach der Auswahl des Streptomyces microflavus-Stamms NEAE-83 und der Sicherstellung seiner Wirksamkeit bei der Bioumwandlung von Chitosan in großen Mengen in CNPs wurde dieser durch mehrere Charakterisierungsverfahren untersucht.

Die Untersuchung von CNPs mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) ergab Details zur Größe und morphologischen Struktur der Oberfläche. CNPs zeigen kugelförmige Partikel (Abb. 5A) mit Gleichmäßigkeit und Homogenität, ohne sichtbare Agglomeration. Das durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) erzeugte Bild der morphologischen Struktur zeigte die Größe von CNPs in einem Bereich von 60 bis 70 nm, ohne Aggregation und Agglomeration (Abb. 5B). SEM und TEM wurden bei der CNP-Identifizierung harmonisiert. Sowohl REM als auch TEM sind effiziente Werkzeuge zur Entdeckung von Nanopartikeln und weithin anerkannte Werkzeuge zur Untersuchung der morphologischen Formation, z. B. Form, Größe und Oberfläche33.

Die biosynthetisierten Chitosan-Nanopartikel unter Verwendung des Streptomyces microflavus-Stamms NEAE-83, nachgewiesen durch die mikroskopischen Aufnahmen von SEM (A), TEM (B) und EDXS (C).

Die in dieser Studie erhaltenen kugelförmigen Partikel stimmten mit der sphärischen oder ovalen Form der meisten CNP-Präparate überein34,35. Darüber hinaus führen die beobachteten gut verteilten und verschlungenen CNPs zur Bildung einer größeren Oberfläche, was darauf hindeutet, dass CNPs für Prozesse geeignet sind, die von Adsorptionskriterien abhängen36.

CNPs mit einer kleinen Partikelgröße (60–100 nm) und einer großen Oberfläche könnten für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Textilien, von entscheidender Bedeutung sein37. Die Partikelgröße von Chitosan-Nanopartikeln hat einen erheblichen Einfluss auf die Eigenschaften dieser Partikel, wenn sie in pharmazeutischen Anwendungen eingesetzt werden. Eine kleinere Partikelgröße hat das Potenzial, eine größere Menge therapeutischer Substanzen einzukapseln, die Stabilität und Bioverfügbarkeit des Arzneimittels zu verbessern und eine Verabreichung des Arzneimittels über einen längeren Zeitraum zu ermöglichen38. Chandrasekaran et al.39 schlugen vor, dass die Oberfläche mit abnehmender Partikelgröße zunimmt. Dies könnte der entscheidende Faktor für die erhöhte antibakterielle Aktivität kleiner Nanopartikel sein.

Im Gegensatz zu Schüttgütern zeigt das aktuelle CNP-Bild keine Agglomeration. Obwohl mehrere Nanopartikel eine hohe Ionenkraft aufweisen können, die eine Aggregation und Agglomeration in der wässrigen Phase verursacht, zeigten die vom Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 synthetisierten CNPs keine Aggregation oder Agglomeration. Es gibt eine deutliche Variation zwischen ihnen. Bei der Aggregation handelt es sich um stark gebundene oder sogar verschmolzene Partikel, während bei der Agglomeration schwach gebundene Partikel sichtbar werden. Es kann jedoch auch eine geringe Agglomeration von CNPs akzeptiert werden40.

Die Arten, Verteilungen und Konzentrationen von Elementen in CNPs wurden mithilfe von EDXS über TEM untersucht (Abb. 5C). Die EDXS-Spektren von CNPs bestätigen die Existenz der Hauptelementkomponente von nativem Chitosan (Kohlenstoff, Stickstoff und Sauerstoff). Während des Herstellungsprozesses können CNPs Veränderungen in der Struktur unterliegen, sodass EDXS dabei helfen kann, Abweichungen zu erkennen. Dabei wird die innere Hülle des Atoms von einem TEM-Elektronenstrahl getroffen, wobei sein Elektron bzw. seine Elektronen durch ein anderes Elektron aus der äußeren Hülle verdrängt werden, um die leere Position zu füllen. Dieser Prozess führt zu einer Variation der Energie in Form von Röntgenstrahlung. Die Intensität der Röntgenstrahlung hängt direkt mit der Konzentration zusammen und ist für jedes Element einzigartig41.

Die Partikelgrößenverteilung der Chitosan-Nanopartikelsuspension wurde in dieser Studie mit einem Partikelgrößenanalysator (PSA) untersucht. Die Größenverteilung wurde bei Raumtemperatur bestimmt und umfasste einen Wellenlängenbereich von 1 bis 760 nm. Die Messung der Partikelgrößenanalyse einer Chitosan-Nanopartikelprobe ergab einen schmalen und scharfen Peak bei 36,6 nm Durchmesser bei θ = 90° und 150,2 nm bei θ = 11,1°, wie in Abb. 6A gezeigt. Die vom Partikelgrößenanalysator erfassten Größen können nur als relative Werte angesehen werden und sind nicht mit den elektronenmikroskopisch ermittelten Größen vergleichbar42. Die Elektronenmikroskopie ist in der Lage, die geometrischen Abmessungen der Partikel zu ermitteln, indem sie die Breite einzelner Partikel aus dem Bild misst und ihre Form und Oberflächenstruktur (z. B. Textur) bestimmt43,44. Die Bildgebung wurde aufgrund ihrer hochauflösenden Visualisierung von Partikeln und der minimalen Auswirkung von Artefakten auf die Größenbestimmung bevorzugt44.

Analysen von Chitosan-Nanopartikeln mit (A) PSA und (B) ζ-Potenzial für die Biosynthese mit dem Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83.

Die biosynthetisierten CNPs wurden untersucht, um den ζ-Potenzialwert herauszufinden. Das dargestellte ζ-Potential (Abb. 6B) zeigt, dass die Dispersion einen einzigen Peak aufweist, der eine brillante Gleichmäßigkeit der CNPs darstellt, die eine positive Ladung mit einem ζ-Potential von + 35,6 mV aufwiesen, was das Vorhandensein von oberflächenprotonierten Amingruppen bestätigt. Der aktuelle ζ-Potentialwert deutet auf eine gute Stabilität der biofabrizierten CNPs hin.

Die Analyse des ζ-Potentials ist eine einzigartige Möglichkeit, die Eigenschaften kolloidaler Dispersionen zu untersuchen. Das Zeta-Potenzial kann aufgrund der elektrostatischen Abstoßung zwischen einzelnen Partikeln einen erheblichen Einfluss auf die Stabilität suspendierter Partikel haben45. Yien et al.46 berichteten, dass das Zeta-Potenzial von Chitosan-Nanopartikeln zwischen + 22 und + 55 mV lag und ihre Hemmwirkung durch die Partikelgröße und das Zeta-Potenzial der Chitosan-Nanopartikel beeinflusst wurde. Kheiri et al.47 zeigten, dass die Zetapotentiale der CNP-Oberflächen eine positive Ladung von etwa 45,6 mV aufweisen. Nach den Erkenntnissen von Khan et al.48, Raza und Anwar49 und Asal et al.50 wurde das Zetapotential auf der Oberfläche von CNPs mit + 31 ± 3,14, + 31,3 und + 31 ± 2,2 mV bestimmt; jeweils. Im Gegensatz dazu berichteten Qi et al.51, dass die Oberflächen von Chitosan-Nanopartikeln eine positive Ladung von etwa 51 mV aufwiesen. Andererseits berichteten Iswanti et al.52, dass die Oberflächen von Chitosan-Nanopartikeln eine positive Oberflächenladung von + 3,3 ± 0,4 mV aufwiesen. Trotz der Tatsache, dass die Suspension physikalisch stabil ist, erwähnten Manikandan und Sathiyabama53, dass ein Zetapotential von mindestens ± 30 mV mindestens erforderlich ist, damit eine NP-Suspension hauptsächlich durch elektrostatische Abstoßung stabilisiert wird. Wenn das Zetapotential kleiner als + 30 mV ist, deutet dies darauf hin, dass die CNPs aufgrund der geringeren elektrostatischen Abstoßung weniger stabil sind54. Ein weiterer Vorteil ist das positive ζ-Potenzial, nämlich als antimikrobielles Mittel. Das positive ζ-Potential der Partikel ermöglicht eine einfache Interaktion mit den negativen Ladungen auf der Zellmembran und der DNA, die dann in das Zytoplasma freigesetzt werden55.

Um einen genaueren Blick auf das Verhalten der CNP-Gemeinschaft zu werfen, wurde eine Kartierungsanalyse durchgeführt. Die aktuelle Kartierungsanalyse der einzelnen Reaktionen von Nanopartikeln wurde durchgeführt, um das Muster der Standorte und Verteilung des elementaren Nanomaterials zu untersuchen (Abb. 7). Die aus der Elektronenmikroskopie gewonnenen Daten zeigen das Gesamtbild der Verteilung der gleichmäßig verteilten CNPs. Allerdings weisen die einzelnen O-, C- und N-Elemente von CNPs das gleiche Muster auf, wobei sie gleichmäßig verstreut und verteilt sind.

Kartierungsanalyse von Chitosan-Nanopartikeln, die mit dem Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 biosynthetisiert wurden.

Eine FTIR-Analyse wurde durchgeführt, um das mögliche Auftreten unterschiedlicher Bindungsfunktionsgruppen mit CNPs aufgrund der Stabilisierungs- und Reduktionswirkung des Überstands des Streptomyces microflavus-Stammes NEAE-83 festzustellen. Das FTIR-Spektrum der biosynthetisierten CNPs wurde analysiert und mit dem FTIR-Spektrum eines Chitosan-Standards verglichen (Abb. 8A, B). Die erste Bandengruppe erschien in den Spektren zwischen 4057 und 3750 cm−1 und weist auf die Kombination der funktionellen Gruppen –NH2, –CH, C–C und –OH hin.

Untersuchung von FTIR für die biosynthetisierten Chitosan-Nanopartikel (A), für Chitosan-Standard (B) und XRD (C) von CNPs, die unter Verwendung des Streptomyces microflavus-Stamms NEAE-83 hergestellt wurden.

Signifikante Verschiebungen der Peaks im CNP-Spektrum gegenüber Peaks im Spektrum des Chitosan-Standards weisen auf eine signifikante Rolle funktioneller Gruppen bei der CNP-Biosynthese hin. Das Vorhandensein von Banden bei 3442 cm−1 in der Chitosan-Standardprobe weist auf eine starke dimere OH-Streckung56 hin. Darüber hinaus verschob sich bei der Bildung von Nanopartikeln der im Spektrum des Chitosan-Standards gefundene Hydroxyl (OH)-Streckschwingungspeak bei einer Wellenlänge von 3442,09 cm−1 auf 3326,66 cm−1, was auf die Streckschwingungen von OH-Gruppen hinweist (Abb. 8A, B). Eine Bande bei 3420 cm−1 wird den kombinierten Peaks der Streckschwingung der –OH- ​​und –NH2-Gruppen in Chitosan zugeschrieben57. Die aliphatische Streckgruppe (CH und CH2) erschien bei 2929 cm−1. Bei 2381–2129 cm−1 sind die Streckschwingungen von C=C konjugiert und C≡C entstanden.

Krishnaveni und Ragunathan56,58 berichteten, dass die Banden bei 1655 cm−1 und die bei 1641, 1642 cm−1 auf das Vorhandensein der Amid-I-Region hinweisen. Darüber hinaus zeigt die Bande bei 1654,98 cm−1 (ca. 1655 cm−1) die Streckschwingung von Typ-I-Amid an. Der intensive Peak der Amid-I-Region verschob sich von 1654,98 cm−1 im FTIR-Spektrum des Chitosan-Standards zu 1641,48 cm−1 im FTIR-Spektrum von CNPs, was auf Wechselwirkungen zwischen protonierten Amingruppen des Chitosan-Standards mit den Komponenten des Kulturfiltrats hinweist des Streptomyces microflavus-Stammes NEAE-83. In Chitosan-Nanopartikeln ist dieser Peak schärfer und verschiebt sich in Richtung 1641,48 cm−1, was auf erhöhte Wechselwirkungen oder Bindungen hinweist. Die Verschiebung der Schwingungen von höheren zu niedrigeren Wellenzahlen zeigt also die Bildung von CNPs57.

Der Peak um 1558 cm−1 im FTIR-Spektrum von CNPs ist auf Streckschwingungen von Amid II (CONH2)57 zurückzuführen. Das CNP-Spektrum zeigte eine Bande um 1412 cm−1, was auf eine aromatische C-C-Streckung hinweist57. Im FTIR-Spektrum des Chitosan-Standards wurde das Vorhandensein der Amid-III-Region durch eine Bande bei 1381 cm−157 angezeigt. Banden bei 1381, 1320 und 895 cm−1 verschwanden im FTIR-Spektrum nach der CNPs-Biosynthese, was zeigt, dass diese Gruppen an der CNPs-Biosynthese durch das Kulturfiltrat des Streptomyces microflavus-Stamms NEAE-83 beteiligt sind. Die Absorption bei der Wellenzahl um 1076 cm−1 entsteht durch die Streckschwingung der CO-Gruppen (COH und COC) in der Sauerstoffbrücke, die durch die Deacetylierung von Chitosan entsteht. Die kleinen Peaks am Ende der FTIR-Spektren entsprechen der Schwankung der Saccharidstruktur von Chitosan45,59.

Die FTIR-Analyse zeigt das Auftreten von Capping-Gruppen an der Oberfläche von CNPs, die die CNPs stabilisieren und ihre Koagulation und/oder Aggregation in der kolloidalen Phase verhindern.

XRD wurde zur Untersuchung des kristallographischen Aufbaus von CNPs verwendet. Das XRD-Muster wird in der Materialwissenschaft als schnelles und primäres Verfahren zur Phasendetektion der Kristallinität verwendet, um einen ausreichenden Überblick über die einzelnen Aspekte zu geben. Aus diesem Grund wurde XRD als Fingerabdruck für eine bestimmte Substanz bezeichnet. Die Bestrahlung mit Röntgenstrahlen führte zu unterschiedlichen Streuwinkeln und Intensitäten des Strahls.

Das XRD-Muster der CNP-Probe zeigte sechs charakteristische Peaks bei 2θ, die bei 11,38, 16,44, 18,27, 22,86, 24,13 und 26,17° lagen (Abb. 8C), was auf eine Verschiebung gegenüber den normalen Chitosan-Peaks hinweist. Rasaee et al.59 berichteten, dass die CNPs Beugungspeaks bei 2θ = 10° (schwacher Beugungspeak) und 20° (starker Beugungspeak) aufwiesen, was zeigt, dass das Chitosan einen hohen Kristallinitätsgrad aufwies. Das XRD-Spektrum von CNPs zeigt die Peakverschiebung gegenüber den normalen Peaks von natürlichem Chitosan, was der Verringerung der Kristallinität und der erhöhten amorphen Struktur entspricht. Die amorphe Struktur von CNPs trägt zu einer erhöhten Sorptionskapazität bei45,60.

Die thermoanalytischen Eigenschaften der bakteriell erzeugten CNPs wurden in einem kontrollierten Temperaturbereich getestet, wobei hauptsächlich zwei Methoden zum Einsatz kamen: thermogravimetrische Analyse (TGA) und Differentialscanningkalorimetrie (DSC). Da die thermoanalytischen Eigenschaften von Nanopartikeln an chemischen Prozessen beteiligt sind. Der Hauptunterschied zwischen TGA und DSC ist die Technik zur Quantifizierung der durch Hitze verursachten Veränderungen in Proben35,60,61.

TGA wurde durchgeführt, um das thermische Verhalten von CNPs als Folge einer kontinuierlichen Schwankung des Heizverhältnisses (von 25 bis 500 °C) zu verfolgen und Massenschwankungen der physikalischen und chemischen Eigenschaften von CNPs bei Temperaturänderungen zu untersuchen (Abb. 9A). . TGA zeigte, dass von 32,73 bis 60,90 °C ein schneller anfänglicher Massenabfall (− 3,756 %) leicht festgestellt werden kann. Bei höheren Temperaturen wurden Gewichtsverluste von CNPs mit mehrstufiger Zersetzung beobachtet. Der Temperaturbereich von 205,92–355,80 °C verzeichnete den höchsten Gewichtsverlust (– 28,683 %), nämlich 1,474 mg, während der niedrigste Gewichtsverlust (– 1,051 %) im Bereich von 483,73–499,90 °C gemessen wurde.

Chromatogramme der TGA- (A) und DSC-Untersuchung (B) von CNPs, die mit dem Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 hergestellt wurden.

Die TGA bestimmt die Differentialthermoanalyse, indem sie die Beziehung zwischen der Änderung der Probenmenge und verschiedenen Temperaturen oder als feste Temperatur zu einem bestimmten Zeitpunkt und konstanten Massenverlust bestimmt35,60,61. Im Allgemeinen führt die Temperatur zu Beginn der TGA zu einer Trockenheit der CNPs und kann aufgrund des Verlusts der in den beiden polaren Gruppen befindlichen wassergebundenen Stoffe leicht zu einem schnellen Massenabfall der CNPs führen. Diese Trocknungsänderung führt nicht zu chemischen Reaktionen oder führt zu einer solchen etwaige bauliche Veränderungen60. Ein weiterer Grund für den anfänglichen Gewichtsabfall könnte der Abbau flüchtiger Einheiten, die Dehydratisierung der Saccharidringe und die Depolymerisation sein36. Später, wenn die Temperatur steigt, kann es aufgrund von Sublimation und/oder Verdunstung zu sequenziellen Verlusten des CNP-Gewichts kommen. Dennoch konnte bei höheren Temperaturen eine mehrstufige Zersetzung aufgrund des thermischen Abbaus von CNPs in Form stufenartiger Muster beobachtet werden61.

Auch wenn die Phasen der TGA während des dynamischen Verhaltens nicht interferierten, wie in der Grafik zu sehen ist, gibt es möglicherweise eine unsichtbare Zersetzungsinterferenz, die entweder eine viel niedrigere Wärmebewertung oder die Verwendung der schrittweisen (schrittweisen) TGA-Ansätze erfordert. Daher reicht TGA allein möglicherweise nicht aus, um die zerstörten Produkte zu erkennen; Daher ist DSC häufig zusätzlich zur TGA unerlässlich, um das Vorhandensein von zerstörten Zwischenprodukten festzustellen35.

Die thermoanalytische Untersuchung des DSC wurde bei verschiedenen Heizraten durchgeführt, um das Ausmaß (positiv oder negativ) der Variation im Wärmefluss von CNPs als Ergebnis der Temperatur beim Vorkommen des Lösungsmittels als Referenz zu klären. Thermoanalytische Informationen wurden sowohl für CNPs als auch für die Lösungsmittelreferenz gesammelt, um ein Phasenschema zu erstellen (Abb. 9B). Mit der Änderung des thermodynamischen Systems wurden Zweiphasenübergänge von CNPs mit bestimmten breiten endothermen Peaks festgestellt. Ein Peak bei 117,22 °C wurde im Bereich von 81–140 °C identifiziert, was −199,95 J Wärme pro Gramm CNPs erforderte. Bei 253,95 °C trat ein weiterer Peak auf, der zu 35,30 J Wärme pro Gramm CNPs führte. Bei 229 °C wurde eine einzige Glasübergangsphase der CNPs nachgewiesen.

Mithilfe der DSC wurde der erforderliche oder freigesetzte Wärmestrom im Verhältnis zur Temperaturänderung zu einem bestimmten Zeitpunkt berechnet. Die thermische Analyse ergab einen gewissen Gewichtsverlust im fortgeschrittenen Stadium aufgrund der Zersetzung der CNPs. Allerdings zerfielen die vom Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 produzierten Nanopartikel bei hohen Temperaturen (500 °C) nicht vollständig und zeigten eine gewisse Konstanz in der Struktur des Polysaccharids, was auf die erhöhte Vernetzungseigenschaft der CNPs zurückzuführen sein könnte, die diese Prozesse durchführen ein stabileres und festeres Netzwerk des Hydrogels36,60,61.

Die Phasenübergänge des thermischen Abbaumechanismus für jeden einzelnen Schritt wurden hervorgehoben. Die DSC-Einstellungen sollen die lineare Haltetemperatur einer Probe als Funktion der Zeit ermöglichen. So können die physikalischen Phänomene eines Materials verfolgt werden, wie z. B. thermische Konstanz, Reinheit und Glasübergang35.

Der erste endotherme Peak wurde aufgrund der Wasserabspaltung bei niedriger Temperatur erzeugt. Später trat bei 253,95 °C ein breiter endothermer Peak auf, der auf das Aufbrechen der CNP-Vernetzung zurückzuführen war. Außerdem wurde in den DSC-Heizkurven bei hoher Temperatur (229 °C) ein einziger Glasübergang (die Phase, in der das Material von einem harten, spröden Zustand in einen weichen, gummiartigen Zustand übergeht) gefunden, was auf das Vorhandensein eines Extrems zurückzuführen ist thermische Konstanz der Vernetzung, was die Konsistenz der CNPs36 demonstriert. Die Verringerung der Kristallinität von CNPs nach der Transformation kann auf Veränderungen im Festkörperaufbau von Chitosan zurückzuführen sein, die durch die Vernetzung verursacht werden, und daher erfolgt der CNP-Abbau oberhalb von 300 °C60.

Alle bisherigen Spezifikationen bieten eine präzise Perspektive zur Charakterisierung von CNPs und stimmten miteinander und mit früheren Arbeiten überein. Darüber hinaus gilt die derzeit vorgeschlagene mikrobielle Methode als ideal für die Herstellung hochwertiger CNPs.

Das Hauptziel der Versuchsoptimierungspolitik besteht darin, die besten Einstellungen für die extreme Biosynthese von CNPs durch den Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 herauszufinden. Der Biofabrikationsprozess durch den Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 wurde auf der Grundlage der fortschrittlichen RSM-Technik optimiert und modelliert, anschließend wurde ein Ansatz der künstlichen Intelligenz angewendet. Die Vorhersagemodelle beider Ansätze wurden generiert und verglichen, ein in diesem Bereich beispielloses Verfahren.

Der statistische Modulationsansatz von RSM wurde verwendet, um eine Vier-Faktoren-Matrix von CCFCD zu erstellen, um die maximale Kombination sowie die Auswirkungen einzelner, Interaktions- und quadratischer Variablen der getesteten unabhängigen Faktoren auf die CNP-Biosynthese durch den Streptomyces microflavus-Stamm NEAE zu untersuchen. 83. Die Designmatrix und die Niveaus (tatsächlich und codiert) der vier getesteten Variablen sowie die untersuchten und vorhergesagten CNP-Werte und ihre Restfehler sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Versuchsläufe zeigten verschiedene Reaktionsgrade, die bis zu 9,41 mg erreichten /ml (Lauf 27).

Basierend auf den von CCFCD erhaltenen Daten wurden die linearen, zweifaktoriellen Interaktions- und quadratischen Modelle verglichen, um das am besten geeignete Modell auszuwählen (Tabelle 3). Ein Vergleich der Modellstatistiken wie fehlende Anpassung und der Summe der Quadrate ergab, dass das quadratische Modell die ideale Wahl war, da für den Wahrscheinlichkeitswert (P > 0,05) ein unbedeutender Mangel an Anpassungsfehlern verzeichnet wurde, während der P-Wert des Modells signifikant war . Sowohl die Summe der Quadrate des Vorhersagefehlers (PRESS) als auch die Standardabweichung waren im Vergleich zu den anderen Modellen geringer. Schließlich wies das quadratische Modell höhere Werte des Bestimmungskoeffizienten (R2), des angepassten R2 und des vorhergesagten R2 auf. Daher wurde das quadratische Modell für den Biofabrikationsprozess der formenden CNPs gewählt. Bei Verwendung des quadratischen Modells, das mit dem CCFCD erstellt wurde, stimmten die vorhergesagten CNP-Werte mit den tatsächlichen überein (Tabelle 2).

Das quadratische CCFCD-Modell wurde basierend auf der Wirksamkeit jedes Modells ausgewählt. Der niedrigere P-Wert (< 0,05) war zuverlässig signifikant für den Modellierungsprozess der CNPs-Biofabrikation. Ein weiteres wichtiges Auswahlkriterium ist R2. Der R2-Wert gibt an, inwieweit die experimentellen Parameter die beobachteten Antwortwerte erklären können62. Wenn R2 0,9 oder größer ist, wird das Modell als ausreichend und präziser für die Vorhersage der Reaktion angesehen63,64. Im Allgemeinen gilt: Je näher der Wert an 1 liegt, desto größer ist die Modellierungskapazität der Daten18. Das vorliegende quadratische Modell hat R2-, angepasste R2- und vorhergesagte R2-Werte, die alle tatsächlich nahe bei eins liegen. Die Änderung der experimentellen CNP-Reaktion führt zu einer Variation der Menge eines Faktors bzw. mehrerer Faktoren. Dies wird als R2-Wert bezeichnet, der für alle R262-Typen immer im Bereich von Null bis 1 liegt. Überraschenderweise führt die Erhöhung der Anzahl der Prädiktoren (Faktoren) unabhängig von der Signifikanz der Faktoren zu einem konstanten Anstieg des R2-Werts. Infolgedessen ist das angepasste R2 eine modifizierte Version von R2, die die Anzahl der Modellfaktoren berücksichtigt. Im Gegensatz zu R2 änderte sich das angepasste R2 deutlich, wenn dem Modell zusätzliche Faktoren hinzugefügt wurden. Daher ist das angepasste R2 ein besserer Indikator als R2 zur Bestimmung der Modellfitness. Schließlich wird das vorhergesagte R2 verwendet, um das Vorhersagepotenzial des Modells zu bewerten, beispielsweise um den CNP-Wert auf neuen, noch nicht getesteten Ebenen der Faktoren vorherzusagen. Die Werte des vorhergesagten R2 und des angepassten R2 sollten innerhalb von 20 % voneinander liegen, was darauf hindeutet, dass das Modell sehr aussagekräftig und genau ist und eine angemessene Übereinstimmung zwischen ihnen besteht65. Die auf der Grundlage des quadratischen CCFCD-Modells berechneten vorhergesagten CNP-Werte kamen denen der experimentellen Werte sehr nahe; Folglich waren die Residuen oder Fehler gering, was einen weiteren Beweis für die Genauigkeit des Modells darstellt. Folglich wurden das lineare Modell und das Zwei-Faktoren-Interaktionsmodell weggelassen und das quadratische Modell als das am besten geeignete Modell für die CNP-Bioverarbeitung durch den Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 ausgewählt.

Die aus dem CCFCD gewonnenen Daten wurden sowohl einer Multiregressions- als auch einer Varianzanalyse (ANOVA) unterzogen (Tabelle 4). Das Gesamtmodell zeigte eine signifikante Leistung bei einem P-Wert < 0,05. Alle Modellterme, einschließlich der Auswirkungen quadratischer, Wechselwirkungs- und linearer Terme, zeigten eine ähnliche signifikante Tendenz, mit Ausnahme der Wechselwirkung der beiden Faktoren des anfänglichen pH-Werts und der Chitosan-Konzentration sowie des quadratischen Effekts sowohl des anfänglichen pH-Werts als auch der Chitosan-Konzentration. Der fehlende Anpassungsfehler des Modells erreichte nicht die Signifikanzschwelle und verzeichnete einen höheren P-Wert von 0,1801. Darüber hinaus zeigten die Modellstandardabweichung, der Variationskoeffizient und die angemessene Präzision eine ordentliche Leistung.

Der niedrige P-Wert zeigte zusammen mit dem hohen F-Wert und dem nicht signifikanten Mangel an Anpassung die Signifikanz des vorgeschlagenen Gesamtmodells an. Der P-Wert wurde als Diagnoseinstrument zur Messung der Signifikanz sowohl des Modells als auch der Faktoren verwendet. Es wurde festgestellt, dass die Prozessvariablen mit P-Werten ≤ 0,05 signifikante Auswirkungen auf die Reaktion haben66. Außerdem sind die meisten der getesteten Terme signifikant (P < 0,05), was die Bedeutung der getesteten Parameter für die Biofabrikation von CNPs darstellt und darüber hinaus darauf hindeutet, dass die Variablen mit ihren Werten und CCFCD gut spezifiziert sind und eine optimale Leistung erbringen Mikrobielle Herstellung von CNPs.

Das Signal-Rausch-Verhältnis wird durch den entsprechenden Präzisionswert gemessen; ein Wert größer als 4 ist erwünscht und weist auf eine starke Modellanpassung66 hin. Das angemessene Präzisionsverhältnis ist größer als 4, was auf den fruchtbaren Raum für die Modellgestaltung hinweist, um die CNP-Biosynthese in den verschiedenen getesteten Bereichen der Faktoren zu maximieren. Ein weiteres Element der Vertrauenswürdigkeit war der Wert des geringfügigen Variationskoeffizienten % (CV%), der für die Zuverlässigkeit des Modells wünschenswert ist. Der sehr niedrige Wert von CV% weist auf eine höhere Präzision der durchgeführten Experimente63. Darüber hinaus sind die drei R2-Typen ausreichend hoch, um die Signifikanz sowohl des Modells als auch seiner Variablen zu unterstützen. Sowohl das angepasste R2 als auch das vorhergesagte R2 stimmten überein. Um eine vernünftige Übereinstimmung zu erreichen, sollten beide R2-Typen nicht mehr als 20 % voneinander betragen18,67, was auf eine hohe Kompatibilität zwischen Versuchs- und Vorhersagewerten biosynthetisierter CNPs hinweist und außerdem die Vorhersagefähigkeit des vernünftigen Modells innerhalb des Designraums unterstreicht. Darüber hinaus ergab die Koeffizientenschätzung eine Vielzahl positiver und negativer Effekte. Die negativen Koeffizienten einiger Modellterme weisen auf die antagonistische Wirkung bei höheren Konzentrationen hin16, eine solche Variable hat einen Einfluss auf den mikrobiellen Aufbau von CNPs. Während ein positiver Koeffizientenwert eine kooperative Auswirkung bezeichnet, erhöht der hohe Wert der Variable(n) die CNP-Biosynthese innerhalb des Designbereichs.

Um die Eignung des Modells zu bestimmen, wurde die Angemessenheit untersucht, indem die Vorhersage im Vergleich zu den tatsächlichen Punkten aufgetragen wurde (Abb. 10A). Die Punkte der Regressionsanalyse liegen viel näher an der perfekten Vorhersagelinie und zeigen eine bessere Übereinstimmung der vom Modell vorhergesagten Werte mit den experimentellen Ergebnissen, was die Genauigkeit des Modells bestätigt5.

Die vorhergesagten gegenüber den tatsächlichen (A) und (B) die Residuen gegenüber den vorhergesagten Werten der Biosynthese von Chitosan-Nanopartikeln unter Verwendung des Streptomyces microflavus-Stammes NEAE-83.

In ähnlicher Weise wurden die extern studentisierten Restwerte des Modells im Vergleich zum vorhergesagten Wert aufgetragen (Abb. 10B). Die Grafik zeigt eine äquivalente Streuung der Restpunkte um die 0-Achse. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Restpunkte in der Nähe der 0-Achse ohne Linearität lagen. Die Grafik zeigte, dass die extern studentisierten Restwerte zufällig um die 0-Achse streuen, was darauf hindeutet, dass die Varianz der experimentellen Ergebnisse für alle Werte konstant ist68. Dieses Verteilungsmuster ist ausreichend perfekt, um die Anwendbarkeit des CCFCD-Modells zu unterstützen. Dementsprechend waren die Varianz der CNP-Daten und der Biosyntheseprozess unabhängig, was die Angemessenheit und Generalisierbarkeit des Modells demonstrierte. Infolgedessen validieren diese beiden Suffizienztests auch das Design und die Datenpunkte.

Um den doppelten Einfluss jedes Faktorpaars auf die CNP-Biosynthese unter Verwendung des Streptomyces microflavus-Stamms NEAE-83 zu untersuchen, wurden die Diagramme der dreidimensionalen (3D) Oberfläche der vier unabhängigen Faktoren erstellt (Abb. 11). Die maximale CNP-Biosynthese lag bei niedriger Chitosankonzentration mit hohem pH-Wert (Abb. 11A), hoher Inkubationstemperatur mit hohem anfänglichem pH-Wert (Abb. 11B), hohem anfänglichem pH-Wert mit kurzer Inkubationszeit (Abb. 11C) und niedrigem pH-Wert Chitosan-Konzentration bei hoher Inkubationstemperatur (Abb. 11D), niedrige Chitosan-Konzentration bei kurzer Inkubationszeit (Abb. 11E) und niedrige Inkubationszeit bei hoher Inkubationstemperatur (Abb. 11F). Außerhalb dieser Bereiche ging die CNP-Biosynthese stark zurück. Bei der Analyse der 3D-Plots konnte ein enger Zusammenhang zwischen jedem Paar der getesteten Faktoren festgestellt werden. Dies bedeutet, dass die Bereiche der Faktoren mit Bedacht gewählt wurden und das Modell am besten für den Entwurf geeignet ist. Dementsprechend wurde die größte Kombination der getesteten in Bezug auf die codierte Ebene basierend auf der Vorhersagefunktion des nächsten CCFCD-Modells geschätzt:

wo X1; anfänglicher pH-Wert, X2; Chitosankonzentration (%), X3; Temperatur (°C), X4; Inkubationszeit (h).

Dreidimensionales Oberflächendiagramm des interaktiven Einflusses jedes Faktorenpaares auf die Biosynthese von Chitosan-Nanopartikeln durch den Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83. Die anderen Faktoren wurden auf der zentralen Ebene gehalten.

Die CCFCD-Daten wurden fortgeschritteneren Modellierungsverfahren unterzogen, d. h. dem auf künstlicher Intelligenz basierenden Ansatz (Tabelle 2) durch maschinelles Lernen. Es wurde ein prädiktives KNN-Modell entwickelt. Für die Modellierung der CNP-Biosynthese durch den Actinomyceten-Kandidaten wurde eine vollständig vernetzte mehrschichtige Feed-Forward-ANN-Plattform erstellt.

Obwohl künstliche Intelligenz Einzug in die neuere wissenschaftliche Forschung gehalten hat, wurde über keine Arbeit zur Modulation der Biofabrikation von CNPs durch ANN berichtet. Dies ist die erste Arbeit, die die Machbarkeit dieser Art der Modellierung demonstriert. Als mögliches Modell für die experimentellen CCFCD-Daten wurde daher künstliche Intelligenz angeboten.

Die feinste architektonische Struktur wurde etabliert, zahlreiche verborgene Schichten und Neuronen innerhalb jeder verborgenen Schicht wurden anhand zahlreicher Muster von KNN-spezifischen Faktoren getestet. Das maschinelle Lernen wurde fortgesetzt, bis die Fehlerwerte, d. h. die mittlere absolute Abweichung (MAD), die Summe der quadratischen Fehler (SSE) und der mittlere quadratische Fehler (RMSE), für beide Trainings ihren Minimalwert erreichten, ergänzt durch den höchsten Wert von R2 und Validierungspunkte (Tabelle 5). Es wurden zahlreiche Lernversuche mit jeweils 5000 Touren durchgeführt. Dementsprechend wurde festgestellt, dass die optimalen ANN-Parameter bei einer Lernrate von 0,1 liegen, wobei das Holdback-Verfahren bei einem Verhältnis von 0,2 zum Einsatz kommt. Die an den Knoten der verborgenen Schichten wirkende Aktivierungsfunktion war der hyperbolische Tangens Sigmoid (NTanH).

Es wurde festgestellt, dass die Topologie von KNN unter solchen Bedingungen eine bessere Leistung erbringt, wenn eine Eingabeschicht aus vier Neuronen (unabhängige Faktoren), eine Ausgabeschicht aus einem Neuron (CNPs-Biosynthese) und eine dazwischenliegende verborgene Schicht mit 20 Neuronen besteht ; (NTanH (20). Dementsprechend wurde die beste Architekturstruktur der ANN-Topologie als 4-20-1 generiert (Abb. 12).

Das endgültige künstliche neuronale Netzwerk der CNPs-Biosynthese durch den Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83. Das Architekturschema zeigt eine Eingabeschicht (4 Neuronen), eine verborgene Schicht (20 Neuronen) und eine Ausgabeschicht mit einem einzelnen Neuron.

Das ANN ist flexibel genug, um effiziente und genaue Modelle aus jeder Art von Antwortoberfläche zu generieren und dabei geeignete verborgene Schichten und Knoten zu verwenden. Die ANN-Plattform verwendet einen Algorithmus für maschinelles Lernen, der Antwortvariablen mithilfe einer flexiblen Funktion vorhersagt. Die Aktivierungsfunktion hilft dem KNN beim Erlernen von Gewichtungen und bildet die komplexe nichtlineare Beziehung ab, auch wenn keine offensichtliche Beziehung zwischen Eingabe- und Ausgabevariablen besteht. Aus diesem Grund kann das KNN Daten sehr gut vorhersagen und anpassen, indem es verschiedene Antwortoberflächen modelliert unter Verwendung der geeigneten Architektur und in der Lage, jede nichtlineare Funktion flexibel und genau zu lernen20,21,69.

Die aktuelle neuronale Netzwerkplattform (4-20-1) verwendet einen Algorithmus für maschinelles Lernen, der als vollständig verbundenes mehrschichtiges Perzeptron bezeichnet wird. Es ist erwähnenswert, dass ANN eine Zwischenschicht anstelle eines direkten Pfads zwischen den Eingabefaktoren und der Ausgabe-CNPs-Variablen aufweist.

Die Zwischenschichten (verborgenen Schichten) spielen eine zentrale Rolle bei der Verwaltung einer eindeutigen Korrelation zwischen Eingaben und Ausgaben und nicht des direkten Pfads. Daher gilt KNN als außergewöhnlicher Prädiktor, wenn die Form der Beziehung zwischen der/den Antwort(en) und den Eingaben nicht erforderlich oder erkennbar ist20,21,69. Die in den Knoten der verborgenen Schicht eingesetzte ANN-Aktivierungsfunktion ist dafür verantwortlich, solche linearen Kombinationen der einzelnen Variablen zu entdecken, ohne die Beziehung zwischen den Eingaben und der Antwort festzulegen20,21,69.

Basierend auf einem solchen Modell wurden die vorhergesagten ANN-Werte für jeden experimentellen Datenpunkt geschätzt (Tabelle 2). Folglich zeigen die von ANN vorhergesagten Werte eine deutlichere Harmonie mit den Testwerten und ihre Residuen zeigten geringere Werte als die, die mit dem CCFCD-Modell ermittelt wurden.

Die vorhergesagten ANN-Werte wurden den tatsächlichen Werten gegenübergestellt (Abb. 13). Die Analyse der linearen Regression zeigt verbesserte Anpassungspunkte im Vergleich zu den tatsächlichen. Die Punkte liegen sowohl für den Trainings- als auch für den Validierungsprozess näher an der Linie der perfekten Prognose, was die Eignung des Modells bestätigt.

Chitosan-Nanopartikel-Biosynthese im Vergleich zu den ANN-Vorhersagewerten und den Restwerten unter Verwendung des Streptomyces microflavus-Stammes NEAE-83 für Trainings- und Validierungsprozesse.

Das Diagramm der Residuenanalyse zeigt eine Streuung der Residuendaten oberhalb und unterhalb der Regressionslinie. Die Residuenanalyse ergab ebenfalls eine normale Streuung der Residuen. Dieses Muster ist ausreichend perfekt, um die Angemessenheit des ANN-Modells zu unterstützen.

Im Vergleich zum CCFCD-Modell weist das ANN-Modell hohe Vorhersagepunkte mit geringeren Residuen auf (Tabelle 2), wobei die lineare Regression und die Residuenanalyse zeigen, dass die Punkte des ANN-Modells (Abb. 13) viel näher an der Steigung des liegen beste Vorhersage als die Punkte des CCFCD-Modells (Abb. 10). Dies kommt zu dem Schluss, dass das ANN die realen Untersuchungsdaten mit einer höheren Vorhersagekapazität präzise anpassen kann. Daher übertrifft die Generalisierungsfähigkeit des ANN-Modells die des CCFCD-Modells.

Die Genauigkeit des Modells zur Vorhersage der mikrobiellen CNP-Biosynthese sowohl durch CCFCD als auch durch ANN wurde weiter mit einer Sammlung statistischer Parameter verglichen, die für das Gesamtmodell sowie für Trainings- und Validierungsgruppen von CCFCD und ANN geschätzt wurden (Tabelle 5). Die R2-Werte des ANN waren für beide Gruppen höher als beim CCFCD-Modell. Im Gegensatz zu CCFCD verzeichneten RMSE und MAD niedrigere Werte für ANN. Der gleiche Trend wurde für das Gesamtmodell beobachtet, d. h. ein größerer R2-Wert und schlechtere RMSE, MAD und SSE von ANN im Vergleich zu CCFCD, was auf die höhere Zuverlässigkeit des ANN-Modells als von CCFCD schließen lässt.

Wie bereits erwähnt, wird R2 verwendet, um den Zusammenhang zwischen der CNP-Reaktion und den prognostizierten Werten zu bestimmen. Daher weist ein größerer Wert in ANN auf einen signifikanteren Zusammenhang zwischen den beiden Datensätzen hin, als in CCFCD angegeben. RMSE führt eine Regressionsbewertung durch, um Versuchsergebnisse zu validieren, da ein niedrigerer Wert bedeutet, dass die Daten um den Bereich mit der besten Anpassung herum aggregiert werden. MAD ist eine weitere Zahl, die die durchschnittliche Streuung der Daten um den Mittelwert angibt. Ein geringer MAD-Wert lässt auf eine geringere Streuung der Daten um den Mittelwert schließen. Der SSE-Wert ist ein zusätzlicher Anpassungstest, der zur Berechnung der Gesamtabweichung der tatsächlichen Werte von den angepassten Werten verwendet wird. Ein niedrigerer Wert bedeutet, dass das Modell in größerem Maße geeignet ist. Die aktuellen Daten stimmen mit den jüngsten Studien überein, in denen festgestellt wurde, dass das ANN-Modell dem RSM überlegen war und niedrigere Werte für RMSE, MAD und SSE sowie höhere Werte für R221,69 verzeichnete. Folglich verfügt ANN über eine bessere Generalisierungsfähigkeit als CCFCD.

Die experimentelle Validierung von CCFCD- und ANN-Modellen zur Maximierung der CNP-Biosynthese durch den Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 wurde anhand der berechneten theoretischen Werte der vier getesteten Faktoren überprüft. Die Erwünschtheitsfunktion wurde verwendet, um die besten Bedingungen für eine maximale CNP-Biosynthese zu finden. Um beide Modelle zu validieren, wurden die optimalen theoretischen Werte, die die CNP-Biosynthese maximieren, von beiden Modellen auf einen anfänglichen pH-Wert von 5,5, 1,3 % Chitosan, 40 °C und eine Inkubationszeit von 12 Stunden geschätzt. Die entsprechende geschätzte CNP-Biosynthese basierend auf CCFCD und ANN betrug 9,29 bzw. 9,44 mg/ml. Unter diesen Bedingungen wurden die theoretischen Werte experimentell ermittelt. Der experimentelle Wert der mikrobiell synthetisierten CNPs durch den Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 betrug 9,52 mg/ml, was einen hohen Präzisionsgrad beider Modelle bestätigt. Der von ANN geschätzte Wert lag jedoch viel näher am experimentellen Wert als der von CCFCD geschätzte Wert, was erneut beweist, dass ANN über eine höhere Vorhersagekraft als das CCFCD-Modell verfügt. Diese Annahme liefert tatsächlich einen robusten Hinweis auf die Eignung des Entwurfs und des Modellierungsverfahrens, indem die getesteten Arrays der vier Faktoren im Biosyntheseprozess der bakteriellen CNPs angewendet werden.

Der aktuelle optimale pH-Wert von 5 wurde zuvor als überlegen gegenüber dem neutralen pH-Wert von 7 beschrieben. Nanopartikel sind bei einem pH-Wert unter 7 tendenziell kleiner und kugelförmig, während die bei einem pH-Wert außerhalb von 7 erzeugten Partikel eher nicht kugelförmig sind größere Größe oder Agglomeration kleiner Partikel70. Unsere Charakterisierungsstudien stützen solche Ergebnisse.

Bei der aktuellen Chitosan-Konzentration von 1,295 mg/ml hat die Chitosan-Intensität einen starken Einfluss auf die Größe und das Wachstum der Nanopartikel. Eine Chitosan-Konzentration von 1,0 mg/ml gehörte zu den besten Bedingungen, um CNPs mit der geringsten Größe (95 nm) im Vergleich zu höheren Konzentrationen zu erzeugen71.

Die Reaktionstemperatur bei 40 °C in der aktuellen Studie könnte aus biotechnologischer Sicht als geeignet angesehen werden. Da die Reaktionstemperatur eine Schlüsselrolle bei der Partikelentwicklung und der Form-/Größenkontrolle spielt, kann die Reaktionstemperatur die Reaktionsgeschwindigkeit und damit die Partikeleigenschaften stark beeinflussen72. Aktuelle Charakterisierungsergebnisse unterstützen die aus dem Optimierungsprozess gewonnenen Daten hinsichtlich Form und Größe.

Die aktuelle Inkubationszeit von 12 Stunden ist eine einigermaßen geeignete Zeit, da Saifful und Shahidan73 berichteten, dass die Verlängerung der Inkubationszeit (18 Stunden) im Vergleich zur kürzeren Zeit (2 Stunden) eine höhere durchschnittliche Größe der Nanopartikel erzeugte. Die gleiche Schlussfolgerung wurde auch von Vaezifar et al.71 gezogen.

Im Gegensatz zu den einstufigen Berechnungsmodellen ist die hohe Präzision der ANN-Vorhersagefähigkeit möglicherweise auf ihre umfassende Fähigkeit zurückzuführen, die Nichtlinearität des Systems abzuschätzen20,21. Es gibt jedoch einige Nachteile der ANN-Modellierung, da ANN einen umfassenden Rechenzeitraum durch Iterationen von Schätzungen verschlingt und die organisierte Natur nicht die Beiträge und die Bedeutung jedes Faktors im Modell nachweisen kann, sodass Faktoren im Modell nicht reduziert oder reduziert werden können aus dem Modell gestrichen21.

Die antibakterielle Aktivität von Chitosan und den hergestellten CNPs wurde gegen das pflanzenpathogene Bakterium Pectobacterium carotovorum mithilfe eines Agar-Diffusions- und Wachstumshemmungstests untersucht. CNPs zeigten im Vergleich zur Chitosanlösung (11 mm) eine signifikante Hemmzone (19 mm) gegen die pathogenen Bakterien, wie in Abb. 14A,B dargestellt. CNPs unterdrückten das Bakterienwachstum deutlich, wenn sie ihre Konzentration in einem flüssigen Medium erhöhten. Die niedrigste Konzentration an CNPs, die das Wachstum von Bakterien verhindern kann, wurde bei 2 mg/ml gemessen.

Antimikrobieller Aktivitätstest von (A) CNPs und (B) Chitosan-Standard gegen Pectobacterium carotovorum, (C) Die minimale Hemmkonzentration (MHK) von Chitosan und CNPs, die vom Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 biosynthetisiert werden.

Chitosan ist als natürliches, ungiftiges Polymer mit antibakterieller Wirkung bekannt. In der Landwirtschaft kann Chitosan als natürliches Pestizid zur Vorbeugung und Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten eingesetzt werden74,75. Chitosan im Nanomaßstab bot neuartige und einzigartige Aktivitäten, einschließlich antimikrobieller, antitumoraler Wirkungen und eines Arzneimittelabgabesystems71. In der aktuellen Studie zeigten die CNPs eine höhere antibakterielle Aktivität als Chitosan gegen Pectobacterium carotovorum. Dies ist auf die einheitliche Kugelform und die geringere Größe der CNPs im Vergleich zu Chitosan zurückzuführen. Der polykationische Charakter von CNPs ermöglicht es ihnen, stärker mit der negativ geladenen Bakterienzellwand zu interagieren als Chitosan selbst. Darüber hinaus verfügen die CNPs über eine große Oberfläche, die eine feste Absorption auf der Bakterienoberfläche erleichtert. Dies führt zu einer Zerstörung der Zellmembran und zum Austritt interzellulärer Verbindungen, was wiederum die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt51. Das Eindringen der CNPs in die Bakterienzelle verursacht DNA-Schäden und verhindert die Proteinsynthese aus RNA76. In Übereinstimmung mit anderen Untersuchungen zeigten unsere Ergebnisse, dass CNPs das Wachstum von Pectobacterium carotovorum mit einem Durchmesser von 19 mm hemmen. Ahmed et al.77 berichteten, dass die CNPs das Wachstum von vier Isolaten grampositiver (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) und gramnegativer Bakterien (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) mit einem Durchmesserbereich von 9 bis 16 mm hemmen. In einer anderen Studie von Divya et al.78 berichteten sie, dass der Durchmesser der von CNPs gegen Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli erzeugten Hemmzone zwischen 12 und 16 mm lag.

Die antimikrobielle Aktivität von CNPs hängt von einer Reihe von Faktoren wie Typ, Molekulargewicht, Polymerisationsgrad von Chitosan, dem verwendeten Lösungsmittel, Temperatur und pH-Wert ab. CNPs weisen auch dosisabhängige und artspezifische antimikrobielle Eigenschaften79 auf. Die grampositiven Bakterien zeigten eine höhere Empfindlichkeit gegenüber CNPs als gramnegative Bakterien. Dabei besteht die Zellwand grampositiver Bakterien aus einer dicken Schicht aus Lipoproteinen und Phospholipiden, die zu einer Erhöhung der negativen Ladung auf der Zelloberfläche führen80. In dieser Studie betrug die minimale Hemmkonzentration von CNPs gegen Pectobacterium carotovorum 2,0 mg/ml (Abb. 14C). Aliasghari et al.81 berichteten, dass die minimale Hemmkonzentration (MHK) von CNPs für vier Streptokokkenstämme im Bereich von 1,25 bis 2,5 mg/ml lag. In ähnlicher Weise haben CNPs eine bakterizide Wirkung gegen sieben Bakterienstämme in Konzentrationen zwischen 0,125 und 5 mg/ml77.

Es wurde über einen bahnbrechenden mikrobiellen Plan für die Synthese von CNPs unter Verwendung eines neuartigen S. microflavus berichtet. Die resultierenden CNPs wurden mithilfe elektronenmikroskopischer Untersuchungen, EDXS, Mapping-FTIR-Spektroskopie, Thermogravimetrie und DSC vollständig identifiziert, was die hohe Qualität des Produkts bestätigte. Zum ersten Mal bei dieser Art der Biosynthese wurden die Prozessparameter untersucht und optimiert, um die Ausbeute an CNPs mithilfe von CCFCD und künstlicher Intelligenz zu maximieren. Die zu lösenden und zu klärenden Herausforderungen sind jedoch die Wirtschaftlichkeit des großtechnischen Produktionsprozesses und ihre Zytotoxizität im Vergleich zu gewöhnlichen CNPs, bevor sie als profitables Ergebnis zugelassen werden.

Zur Isolierung von Streptomyces sp. wurde die übliche Verdünnungsplattentechnik verwendet. Stamm NEAE-83, aus einer Bodenprobe aus El Warraq, Gouvernement Gizeh, Ägypten, auf Petrischalen mit Stärkenitrat-Agar-Medium der folgenden Zusammensetzung (g/L): Stärke, 20; MgSO4.7H2O, 0,5; KNO3, 2; NaCl, 0,5; K2HPO4, 1; FeSO4.7H2O, 0,01; CaCO3, 3; Agar, 20. Petrischalen wurden 7 Tage lang bei 30 °C inkubiert. Die isolierten Stämme wurden in 20 % (v/v) Glycerin als Sporensuspensionen bei –20 °C gehalten.

Die Masse mit niedrigem Molekulargewicht (Sigma-Aldrich) wurde mit 0,5 % (V/V) Essigsäure zu 2 % (Gew./Vol.) verflüssigt und dann mit 1 N NaOH unter magnetischem Rühren 24 Stunden lang auf einen pH-Wert von 4,8–5,0 erhöht und vervollständigt auf 200 ml.

Das optimale Wachstumsmedium des Actinomyceten Streptomyces sp. Stamm NEAE-83 (Inokulumkonzentration) waren K2HPO4 (0,05 %), MgSO4 (0,05 %), NaCl (0,05 %), KNO3 (0,1 %), FeSO4 0,7H20 (0,001 %), Hefeextrakt (0,03 %), Stärke ( 2%) und pH 7,5. Ein Volumen von 2 ml Kulturfiltrat wurde mit 1 ml Chitosanlösung (1 %) gemischt und 12–36 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln mit 150 U/min inkubiert, um eine opaleszierende Lösung zu erhalten.

Die kolloidale Suspension wurde zentrifugiert (10 Min. bei 10.000 xg). Der resultierende Niederschlag wurde zweimal gewaschen, um den nicht umgesetzten Bestandteil zu entfernen. Das Ergebnis wurde erneut in 1 %iger Essigsäure gelöst. Die biosynthetisierten CNPs wurden im UV-sichtbaren Spektrum bestimmt und überwacht, indem die Spitzenabsorption mit dem Doppelstrahl-Optizen-Pop-UV/VIS-Spektrophotometer bei einem Array zwischen 200 und 400 nm erfasst wurde. Der Niederschlag wurde anschließend gefriergetrocknet. Aus CNPs wurde eine Kalibrierungskurve erstellt, wobei bekannte Konzentrationen (mg/ml) durch Auflösen in 1 % Essigsäure verwendet wurden, um die Nettoausbeute an CNPs abzuschätzen.

Die Sporenoberfläche und die Sporenkettenstruktur des Bakteriums wurden auf Stärkenitrat-Agar nach 14-tägigem Wachstum bei 30 °C untersucht. Das dehydrierte goldbeschichtete Bakterium wurde bei verschiedenen Amplifikationen mit analytischem REM (Jeol JSM-6360 LA) untersucht.

Die physiologischen Merkmale, z. B. Produktion diffusionsfähiger und melanoider Pigmente (auf Brühemedium aus Hefeextrakt-Trypton und Agarmedien aus Pepton-Hefeextrakt-Eisen und Tyrosin), Koagulation und Peptonisierung von Milch, Stärkehydrolyse, Chitosanase, L-Asparaginase , Protease, Uricase, Cellulase, Nitratreduktion, Gelatineverflüssigung, H2S-Produktion und NaCl-Toleranz wurden bestimmt2. Die Fähigkeit von Streptomyces sp. Stamm NEAE-83 das Wachstum einiger Bakterien (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella sp. und Escherichia coli) und Pilze (Fusarium solani, F. oxysporum, Alternaria solani, Bipolaris oryzae und Rhizoctonia solani) hemmt, wurde ebenfalls geklärt2 .

Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 5000 × g in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geerntet, der Überstand wurde entfernt. Die genomische DNA wurde wie beschrieben mit der Methode der PCR-Amplifikation des 16S-rRNA-Gens hergestellt, die unter Verwendung des Protokolls von El-Naggar et al.17 durchgeführt wurde. Das vorbereitete Lysat wurde mit einer GeneJETTM genomischen DNA-Reinigungssäule gereinigt. Die PCR-Amplifikationsreaktion wurde in einer Mischung aus 25 μl Maxima Hot Start PCR Master Mix (2X) und 1 μl 20 pmol 16S-rRNA-Forward-Primer 27f durchgeführt. (5′-AGAGTTTGATCMTGCCTCAG-3′), 1 µl 20 pmol 16S rRNA Reverse Primer 1492 r (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′), 5 µl Template-DNA und 18 µl Wasser, nukleasefrei.

Der Temperaturzyklus des PCR-Geräts wurde wie empfohlen programmiert (10 Minuten bei 95 °C für die anfängliche Denaturierung und Enzymaktivierung, gefolgt von 35 Amplifikationszyklen von 30 Sekunden bei 95 °C, 1 Minute Annealing bei 65 °C und 1,5 min bei 72 °C, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung für 10 min bei 72 °C). Danach wurde die PCR-Produktmischung der Agarosegelelektrophorese unterzogen und mit dem GeneJET™ PCR Purification Kit (Thermo K0701) gereinigt. Die resultierende gereinigte PCR wurde bei GATC Company mit dem DNA-Sequenziergerät ABI 3730xl unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern sequenziert. Die 16S-rRNA-Gensequenz von Streptomyces sp. Stamm NEAE-83 (1214 bp) wurde in der GenBank-Datenbank gelöscht, um die Zugangsnummer abzurufen.

Die Gensequenz von Streptomyces sp. Der Stamm NEAE-83 wurde mit den Sequenzen dieser anderen Streptomyces-Stämme in den GenBank-Datenbanken (EMBL, DDBJ und PDB) verglichen und die 16S-rRNA-Gensequenzen wurden zur Konstruktion eines phylogenetischen Baums (Nachbarnverbindungsbaum) zur Darstellung der Beziehungen verwendet zwischen Streptomyces sp. Stamm NEAE-83 und verwandte Streptomyces-Arten. Es wurde das Softwarepaket MEGA-X verwendet.

Die erzeugten CNPs wurden durch Goldsputtern (SPI-Modul) beschichtet, dann wurden Morphologie, Größe und Konstruktion durch SEM (Modell JEOL-JSM-IT200) bei 20 kV untersucht. Eine weitere morphologische Untersuchung von CNPs wurde mittels TEM durchgeführt. Proben der erzeugten CNPs wurden mit der TEM-Einheit (TEM; JEM-2100 Plus, JEOL Ltd., Japan) untersucht.

Die Charakterisierung und Elementkonfiguration von CNPs wurden von EDXS entdeckt. Um vertiefte Erkenntnisse über die CNPs zu erlangen, wurde der Elektronenstrahl des REM zur Untersuchung einzelner CNPs genutzt. Die mit dem Programm gewonnenen Daten wurden analysiert.

Mithilfe von SEM wurde eine Kartierungsanalyse durchgeführt, um ein Übersichtsbild der CNPs zu erstellen und deren Zusammensetzung und Verteilung zu untersuchen.

Dynamische Laserstreuung (DLS) mit dem N5-Submikron-Partikelgrößenanalysator von Beckman Coulter wurde verwendet, um die Partikelgrößenverteilung der CNPs zu messen.

Die Oberflächenladungseigenschaften der CNPs wurden unter Verwendung des ζ-Potentials durch die Software des Malvern Analytical Zetasizer (Version 7.13) quantifiziert, mit einem Laser-Doppler verstärkt und durch die Phasenanalyse-Lichtstreuung unterschieden. Die Bestimmungen wurden bei 25 °C durchgeführt, wobei die CNPs im flüssigen Zustand aufgenommen wurden82.

Die Oberflächeneigenschaften der CNPs wurden durch FTIR-Spektroskopie mit dem Shimadzu FTIR-8400 S-Spektrophotometer ermittelt. CNPs wurden mit KBr-Pellets zerkleinert, dann wurde das FTIR-Spektrum mit einer Auflösung von 1 cm−1 über den Bereich zwischen 4500 und 500 cm−1 aufgenommen.

Die strukturellen Eigenschaften von CNPs wurden mithilfe von XRD aufgeklärt, einem wichtigen Verfahren zur Entdeckung des XRD-Musters. Zum Einsatz kam das Diffraktometer (Bruker D2 Phaser 2nd Gen), bei dem die Röntgenstrahlung mit einer Cu-Anode mit 30 kV und 10 mA arbeitet. Die Beugungsintensität wurde bei 25,7 °C mit einer Scanrate von 2°/min für 2θ = 10–50 von Khan et al.83 bestimmt.

Die CNPs-Probe wurde durch einstündiges Trocknen bei 60 °C vorbereitet, bevor sie in eine Platin-Probenschale gegeben wurde. TGA wurde mit einer Flussrate von 20 ml/min im Bereich von 25 bis 500 °C durchgeführt. Der Thermoanalysator (50-H) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre mit einer Anstiegsrate von 10 °C min−1 verwendet. Das Diagramm wurde als Prozentsatz des Gewichtsverlusts gegenüber der Temperatur aufgetragen.

Das CNP-Pyrolysemuster von DSC wurde nach einstündigem Trocknen bei 60 °C geschätzt. Die CNP-Probe wurde in der Aluminiumpfanne montiert. Der DSC-Test (60-A) wurde in einer Stickstoffatmosphäre mit Durchfluss- und Heizverhältnissen von 30 ml/min bzw. 10 °C/min durchgeführt. Das Thermogrammverhalten wurde zwischen 25 und 500 °C untersucht. Die DSC-Obertemperatur war die ursprüngliche Zersetzungstemperatur von CNPs, wie durch die thermogravimetrische Untersuchung ermittelt. Das Diagramm wurde als Temperatur vs. Wärmestrom aufgetragen.

Central Composite Face-Centered Design (CCFCD) ist ein wirksamer Ansatz, der häufig in Optimierungsverfahren eingesetzt wird, da er genügend Informationen zur Bestätigung der Modellgenauigkeit liefert, ohne dass eine große Anzahl von Experimenten erforderlich ist, wodurch die Gesamtkosten des Experiments minimiert werden84. Die CCFCD-Matrix wurde erstellt, um die größte Kombination der getesteten Faktoren zu bestimmen, die die Biofabrikation von CNPs durch den Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83 beeinflussen. Es wurden drei Stufen jeder Variablen (kodiert als − 1, 0, + 1) angewendet. Dem Entwurf wurden 5 Mittelpunkte zugewiesen. Dementsprechend wurden dreißig Läufe generiert (Tabelle 2). Die kodierten Werte wurden verwendet, da die Kodierung besser geeignet ist, die relative Auswirkung der Faktoren durch Vergleich der Faktorkoeffizienten zu ermitteln. Die kodierten Werte der untersuchten Faktoren wurden aus dem tatsächlichen Wert durch die folgende Funktion geschätzt:

Dabei ist xi der codierte Wert eines getesteten Faktors, Xi der reale Wert eines getesteten Faktors, X0 der reale Wert des getesteten Faktors am Mittelpunkt und ∆Xi die schrittweise Änderung des tatsächlichen Werts der Variablen i .

Die tatsächlichen Werte waren der anfängliche pH-Wert; 4,5–5,5, anfängliche Chitosankonzentration; 1–2 %, Temperatur; 30–40 °C und Inkubationszeit; 12–36 Std. Die linearen, quadratischen und gegenseitigen Auswirkungen der genannten Prozessfaktoren wurden abgeschätzt, um den Zusammenhang zwischen der CNP-Erzeugung und dem optimalen Niveau der untersuchten Faktoren, die den Biosyntheseprozess beeinflussen, herauszufinden. Die folgende Polynomgleichung zweiter Ordnung wurde verwendet:

Dabei ist Y die CNP-Biosynthese unter Verwendung des Streptomyces microflavus-Stamms NEAE-83, Xi das Niveau der Prozessvariablen, β0 die Regressionskoeffizienten, βi der lineare Koeffizient, βij die gegenseitigen Koeffizienten und βii die quadratischen Koeffizienten.

Es wurde ein vollständig verknüpftes neuronales Netzwerkprogramm erstellt, das verschiedene Knoten innerhalb seiner Schichten verwendet. Alle Knoten verfügen über eine NTanH-Aktivierungsfunktion. Zur Entwicklung eines Vorhersagemodells mithilfe künstlicher Intelligenz wurden die CCFCD-Matrix und experimentelle Daten (Tabelle 2) verwendet, um das verbundene mehrschichtige Perzeptron von ANN zu trainieren. Die CCFCD-Daten wurden in Training (um neuronale Gewichte zu erstellen und Vorhersagefehler zu minimieren), Validierung (um das beste Modell auszuwählen und das Training zu stoppen) und Testen (zur Bewertung der ANN-Prognosekompetenz) unterteilt.

Die Design-ANN-Topologie besteht aus der Eingabeschicht, die durch die vier unabhängigen Faktoren fixiert ist, und der Ausgabeschicht, die nur ein festes Neuron aufweist (CNPs-Biosynthese durch den Streptomyces microflavus-Stamm NEAE-83). Dazwischen befanden sich die verborgenen Schichten, die anhand verschiedener Kriterien untersucht wurden, darunter die Anzahl der Neuronen, das Holdback-Ausbreitungsverhältnis und die Lernraten. Die ANN-Topologie wird als 4-h-1 bezeichnet.

Das Trial-and-Error-Verfahren wurde für die Modellauswahl und die Bewertung der Wirksamkeit des maschinellen Lernens verwendet, die auf der Grundlage von RMSE-, MAD-, SSE- und R2-Tests ermittelt wurde. Zum anderen entsprachen die vorhergesagten Ergebnisse sehr nahe der tatsächlichen Reaktion der CNP-Biosynthese. Die Fitness von CCFCD- und ANN-Modellen wurde mit den entsprechenden experimentellen Werten verglichen.

Die Software Design Expert (Version 13, Stat-Ease, Minneapolis, USA) wurde verwendet, um die CCFCD-Designmatrix einzurichten und die statistischen Untersuchungen durchzuführen. Das maschinelle Lernverfahren, der Aufbau der ANN-Topologie und statistische Untersuchungen wurden mit Hilfe des Softwarepakets durchgeführt; JMP Pro, Version 16.2 (JMP, SAS Institute Inc., Cary, NC), mit der die Schulungs-, Validierungs- und Testprozesse durchgeführt wurden.

Eine Stammkultur von Pectobacterium carotovorum (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Muhammad Zayed, Abteilung für Botanik und Mikrobiologie, Universität Menoufia, Ägypten) wurde in steriles Luria-Bertani (LB)-Brühemedium untergeimpft und über Nacht bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Nach 24 Stunden wurde die Bakteriensuspension mit steriler Kochsalzlösung auf 108 KBE/ml (0,5 McFarland-Standard) eingestellt. Einhundert Mikroliter der Bakteriensuspension wurden mit sterilen Tupfern auf der Oberfläche der LB-Agarplatte verteilt. Dann wurden ein mit 20 µg CNPs gesättigtes Stück Stoff mit 1 cm Durchmesser und ein weiteres mit 20 µg Chitosan-Standard gesättigtes Stück Stoff auf die Oberfläche der beimpften Platten gelegt. Die Platten wurden gekühlt, um die Materialdiffusion in das Agar zu verbessern, und die Platten wurden 18 Stunden lang bei 30 °C inkubiert.

Die MHK von CNPs wurde mit der Mikroverdünnungsmethode gegen Pectobacterium carotovorum bestimmt. Die Stammlösungen von Chitosan-Standard und CNPs wurden seriell von 0,25 auf 2,0 mg/ml in LB-Brühemedium verdünnt und für jede Konzentration dreifach gleichmäßig in eine sterile 96-Well-Mikrotiterplatte verteilt. Jede Vertiefung wurde mit 20 µL einer Bakteriensuspension (105 KBE/Vertiefung) beimpft. Als Negativkontrollen wurden Vertiefungen mit Kulturmedium und unterschiedlichen Konzentrationen an Chitosan-Standard und CNPs ohne Inokulation verwendet. Das Bakterienwachstum wurde durch Trübungsmessungen bei 550 nm nach Inkubation über Nacht geschätzt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seiner ergänzenden Informationsdatei enthalten.

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Die Autoren danken der Stadt für wissenschaftliche Forschung und technologische Anwendungen (SRTA-City), Alexandria, 21934, Ägypten, für die finanzielle Unterstützung für Labormessungen und Analysen dieses Papiers im Rahmen der SRTA-City Central Laboratories Services.

Open-Access-Finanzierung durch die Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) in Zusammenarbeit mit der Egyptian Knowledge Bank (EKB).

Abteilung für Bioprozessentwicklung, Forschungsinstitut für Gentechnik und Biotechnologie, Stadt für wissenschaftliche Forschung und technologische Anwendungen (SRTA-Stadt), New Borg El-Arab City, Alexandria, 21934, Ägypten

Noura El-Ahmady El-Naggar & Nashwa H. Rabei

Abteilung für Pflanzenschutz und biomolekulare Diagnose, Forschungsinstitut für Aridlandkultivierung, Stadt für wissenschaftliche Forschung und technologische Anwendungen (SRTA-Stadt), New Borg El-Arab City, Alexandria, 21934, Ägypten

Shima I. Bashir

Abteilung für mikrobielle Aktivität, Abteilung für Mikrobiologie, Forschungsinstitut für Böden, Wasser und Umwelt, Agrarforschungszentrum, Gizeh, 12619, Ägypten

WesamEldin IA Säbel

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NEE schlug das Forschungsthema vor, entwarf den Forschungsplan, stellte die notwendigen Werkzeuge für Experimente und Versuchsanweisungen zur Verfügung, sammelte die Daten, führte die statistische Analyse durch und trug zur Interpretation der Ergebnisse sowie zum Verfassen und Überarbeiten des Manuskripts bei. SIB führte die Experimente zur antimikrobiellen Aktivität durch und trug zum Verfassen und Überarbeiten des Manuskripts bei. NHR führte einige der Experimente durch. WIS-Interpretation der Ergebnisse, Verfassen und Überarbeiten des Manuskripts. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Noura El-Ahmady El-Naggar.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

El-Naggar, N.EA., Bashir, SI, Rabei, NH et al. Innovative Biosynthese, auf künstlicher Intelligenz basierende Optimierung und Charakterisierung von Chitosan-Nanopartikeln durch Streptomyces microflavus und ihr Hemmpotenzial gegen Pectobacterium carotovorum. Sci Rep 12, 21851 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25726-w

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Eingegangen: 10. Mai 2022

Angenommen: 05. Dezember 2022

Veröffentlicht: 17. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25726-w

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Wissenschaftliche Berichte (2023)

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